一般来说,目前的PCR Kit中各种试剂都可以在反应之前混合好,放入PCR仪器后不需要中途添加。如PCR buffer中主要含有各种离子,提供反应所需要的适合的环境(注意有些镁离子在Buffer中已经含有,有些是要另外填加的),另外需要dNTP,针对你的目的基因的引物,你的模板,最重要的是Taq酶。这些在冰上混合好,放在PCR仪器上开始反应即可,所有成分已经具备,不需要另外加别的。
为了减少非特异性,也可先不添加Taq酶,在PCR反应温度上升到94度时候,把酶加入,相当于“热启动”。但是由于操作不便,一般无需这样,而且有商业化的“热启动酶”可以购买
说起来麻烦做起来不是很麻烦,我们是算好了,照着加的~
真不愿意回想啊。。。:{
水,buffer,dNTP,Taq酶,引物,DNA。。。应该是这些了吧。。。
加入后就PCR了~
酶是到用的时候才拿出来的,加完放回去,防变性
只是做过,不是高手~
模板DNA,引物(两条),dNTP,酶,相应的buffer然后用水补足体积。
一次性全都加好,混合均匀,然后在PCR仪上设好程序放进去就可以了。机器会自动按程序进行的。没有特别的先后顺序,只要全都加进去了就可以了。最好是在冰上进行,也就是所谓的冷启动,防止非特异性条带的扩增。
在PCR扩增仪中是自动完成的。
需要一段已知目的基因的核苷酸序列,然后根据这合成引物(本质是一段RNA)。
还需要DNA聚合酶。