①基因分离定律的实质是等我基因分离，使得具有对相对性状亲本杂交F2性状分离为比3：1，①错误；
②S型肺炎双球菌的DNA使某些R型肺炎双球菌转化成S型，类似于基因工程，原理是基因重组，②正确；
③基因自由组合定律的实质是非同源染色体上非等位基因自由组合，使得具有二对相对性状的亲本杂交F2性状分离比为9：3：3：1，③错误；
④在减数第一次分裂的后期，具有二对相对性状F1形成配子时，非同源染色体上的非等位基因重新组合，属于基因重组，④正确；
⑤具有二对相对性状F1与双隐性个体测交后代表现型比例为1：1：1：1，属于基因自由组合定律的验证实验，⑤错误；
⑥人的胰岛素基因导入酵母菌后培育成工程菌属于基因工程，原理是基因重组，⑥错误．
故选：C．
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